Anvendelsen af ​​realtid RT-PCR i Covid-19

Hvad er realtid RT – PCR?

Tilføjelse af fluorescerende gener til PCR-reaktionssystemet ved hjælp af fluorescenssignalakkumulering til at overvåge hele PCR-processen i realtid og derefter kvantificering af den ukendte skabelon gennem en standardkurve kaldes realtid fluorescens kvantitativ PCR-teknologi, også kendt som realtid Q -PCR.

Princippet for PCR-amplifikation er det samme som for almindeligt PCR-instrument, bortset fra at primerne, der er tilføjet under PCR-amplifikation, er mærket med isotoper, fluorescein osv., Og primerne og fluorescerende prober anvendes til specifikt at binde til skabelonen til amplifikation ved den samme tid.

De amplificerede resultater opsamles og transmitteres til computeranalyse og -behandlingssystemet gennem realtidsindsamlingssignalet for fluorescenssignalopsamlingssystemet for at opnå et kvantitativt realtidsresultatoutput.

Realtid RT – PCR er en af ​​de mest anvendte laboratoriemetoder til påvisning af COVID-19-virus. Mens mange lande har anvendt RT-PCR i realtid til diagnosticering af andre sygdomme, såsom ebolavirus og Zika-virus, har mange brug for støtte til at tilpasse denne metode til COVID-19-virussen samt til at øge deres nationale testkapacitet.

Hvordan fungerer realtid RT – PCR med COVID-19-virussen?

En prøve indsamles fra de dele af kroppen, hvor COVID-19-virussen samles, såsom en persons næse eller hals. Prøven behandles med adskillige kemiske opløsninger, der fjerner stoffer som proteiner og fedt, og som kun ekstraherer det RNA, der findes i prøven. Dette ekstraherede RNA er en blanding af personens eget genetiske materiale og, hvis det er til stede, virusets RNA.

RNA transskriberes omvendt til DNA under anvendelse af et specifikt enzym. Forskere tilføjer derefter yderligere korte fragmenter af DNA, der er komplementære til specifikke dele af det transkriberede virale DNA. Hvis virussen er til stede i en prøve, binder disse fragmenter sig til målsektioner af det virale DNA. Nogle af de tilsatte genetiske fragmenter bruges til at opbygge DNA-strenge under amplificering, mens de andre bruges til at opbygge DNA'et og tilføje markørmærker til strengene, som derefter bruges til at detektere virussen.

Blandingen anbringes derefter i en RT – PCR-maskine. Maskinen cykler gennem temperaturer, der opvarmer og afkøler blandingen for at udløse specifikke kemiske reaktioner, der skaber nye, identiske kopier af målsektionerne for viralt DNA. Cyklussen gentages igen og igen for at fortsætte med at kopiere målsektionerne for viralt DNA. Hver cyklus fordobler det forrige nummer: to kopier bliver fire, fire kopier bliver otte osv. En standard real-time RT – PCR-opsætning gennemgår normalt 35 cyklusser, hvilket betyder, at ved afslutningen af ​​processen oprettes omkring 35 milliarder nye kopier af sektionerne af viralt DNA fra hver virusstreng, der findes i prøven .

Når nye kopier af de virale DNA-sektioner bygges, fastgøres markørmærkaterne til DNA-strengene og frigiver derefter et fluorescerende farvestof, der måles af maskinens computer og vises i realtid på skærmen. Computeren sporer mængden af ​​fluorescens i prøven efter hver cyklus. Når et vist niveau af fluorescens overgås, bekræfter dette, at virussen er til stede. Videnskabsmænd overvåger også, hvor mange cyklusser det tager at nå dette niveau for at estimere infektionens sværhedsgrad: Jo færre cyklusser, desto mere alvorlig er virusinfektionen.

Hvorfor bruge RT-PCR i realtid?

RT-PCR-teknikken i realtid er yderst følsom og specifik og kan levere en pålidelig diagnose på så lidt som tre timer, selvom laboratorier i gennemsnit tager mellem seks og otte timer. Sammenlignet med andre tilgængelige virusisoleringsmetoder er realtid RT – PCR betydeligt hurtigere og har et lavere potentiale for kontaminering eller fejl, da hele processen kan udføres i et lukket rør. Det er fortsat den mest nøjagtige metode til rådighed til påvisning af COVID-19-virussen.

Imidlertid kan realtid RT – PCR ikke bruges til at detektere tidligere infektioner, hvilket er vigtigt for at forstå udviklingen og spredningen af ​​virussen, da virus kun er til stede i kroppen i et specifikt tidsvindue. Andre metoder er nødvendige for at detektere, spore og studere tidligere infektioner, især dem, der kan have udviklet sig og spredt uden symptomer.