Ofte stillede spørgsmål om brudte celler

1. E. coli udtrykker udenlandske protein. Når sonicated, er det suspenderet i PBS, som indeholder 1% triton-X-100. Effekten af ultralyd er bedre. Effekten af 1% triton-X-100 er stadig indlysende. Nogle andre bakterier også arbejde, såsom Streptomyces. Efter at udtrykke den rekombinante protein, celler blev afbrudt af ultralyd celle forstyrrelser, ved hjælp af isbad, 400w, og knust for 2s for 1s, men en stor mængde af skum blev genereret i en kort tid, som ramte den knusende effekt. Både pbs og tris buffere var som denne. Er opsplitning ufuldstændige og target proteinet i disse ubrudt celler, hvad skal jeg gøre?

Analyse: Boblen vil blive genereret, fordi stillingen sonden ikke placeres godt; Sonden skal være tæt på bunden, omkring 0,5-1 cm; magt vil variere afhængigt af instrumentet, men den flydende niveau kan observeres, der er udsving, men ikke for stærk; Du kan vælge ultralyds celler knuser er brudt for 3s for 10s og brudt 20 - 30 gange. Placeringen af horn bør også bemærkes. Hvis lyden er forkert, bør det justeres i tid; i betragtning af koncentrationen af bakterier. Prøv at øge volumen når knusning, styrken af Zui bør ikke overstige 60%. forsøge at bryde 8s for 8s, for nogle bakterielle proteiner, er det vanskeligt at sprede protein til at forårsage protein denaturering til at producere bobler, som kan stå i pause i lidt længere. Et protein, der findes i form af inklusion organer.

2. Hvad er betingelserne for sonikering af Streptomyces (bakterier)?

Analytiske: bakterier tilhører (G + C) molær procentdel (mol %) af de Gram-positive (Eubacteria) forgrening gruppe om fylogenetiske træet af prokaryotisk system, der har de molekylære og biologiske karakteristika unik for prokaryoter. Men, i de forskellige grupper, den kemiske sammensætning af cellevæggen varierer meget. I ultralyd E. coli 400W bruges, og metoden til bryde 5s for 5s er effektiv, men det bruges på Streptomyces og det har ingen effekt på grund af forskellen i cellevæggen sammensætning. Før spinding behandling af Streptomyces (bakterier) er generelt konfigureret til en vis koncentration af bakteriel suspension. De særlige betingelser for knusning ved hjælp af ultralyd celle disruptor: indsamle bakterier i 24 h kultur løsning på 5 000 r / min til 5 min til at indsamle cellerne; vaskemaskine med en pH 7,5 Na2HPO-NaH2PO buffer 3 gange, og derefter cellerne blev formuleret i en 1:3 bakteriel suspension ved hjælp af bufferen. Placeret i et 40 mL store plast reagensglas; store plast test røret anbringes i isbad og knuse den med en ultralyds celle Disrupters (power 200W, 1/2" sonde, knuse for 30s, intermitterende 30s); knusning løsning på 12 000 r/min. centrifugeres ved høj hastighed til 30 min, indsamle celle debris og supernatanten. Vask celler kan også vaskes engang med pre afkølet saltvand eller Tris-HCl pH-værdi på 8. Desuden, varierer ultralyd dosis meget med mængden af prøven og bakterier. Magt kan være 400-600w, knust for 5s, stoppede for 5s, er is bad, og den endelige koncentration af 1 mM PMSF tilføjet. For at bestemme den passende ultralyd intensitet og hyppighed, er det nødvendigt at kontrollere, at bakterier er helt brudt til enhver tid.